北(běi)京時間2022年12月16日，江門市新會區威信高技術科學研究所（以下(xià)簡稱廣東省智能院）王斌研究員(yuán)實驗室（腦認知(zhī)神經網絡發育和疾病研究組）與中(zhōng)國科學院分(fēn)子細胞科學卓越創新中(zhōng)心鮑岚研究員(yuán)實驗室以及複旦大(dà)學生(shēng)物(wù)醫學研究院楊力研究員(yuán)實驗室合作在國際學術期刊 EMBO Reports以Resource形式在線發表了題爲“ Somatosensory neurons express specific sets of lincRNAs, and lincRNA CLAP promotes itch sensation in mice”的研究論文。該研究通過單細胞測序系統性地分(fēn)析并構建了初級感覺神經元中(zhōng)細胞類型特異性的長鏈基因間非編碼RNA（long intergenic noncoding RNA，lincRNA）表達譜，同時揭示細胞類型特異表達lincRNA CLAP參與調控癢覺功能及其分(fēn)子機制。
王斌研究員(yuán)和鮑岚研究員(yuán)團隊長期對非編碼RNA在神經元發育中(zhōng)的功能及其分(fēn)子機制進行研究。課題組前期的研究工(gōng)作發現，初級感覺神經元軸突中(zhōng)富集的microRNAs（miRNAs）通過調控軸突中(zhōng)的mRNA局部翻譯參與軸突延伸（Wang et al., Cell Reports, 2015; Wang & Bao, Journal of Molecular Cell Biology, 2017）。課題組最近的研究發現，軸突富集的長鏈非編碼RNA（lncRNA）ALAE通過競争RNA結合蛋白(bái) KHSRP與Gap43 mRNA的相互作用進而調節軸突局部翻譯和軸突生(shēng)長(Wei et al., Cell Reports, 2021)，lncRNA Dubr的m6A動态修飾通過穩定RNA結合蛋白(bái)YTHDF1/3介導mRNA翻譯從而參與神經元遷移和軸突發育（Huang et al., Cell Reports, 2022），這些研究進一(yī)步揭示了神經元特異分(fēn)布的非編碼RNA在神經系統發育中(zhōng)發揮重要調控作用。
初級感覺神經元屬于假單極神經元，它的胞體(tǐ)聚集形成背根神經節（Dorsal root ganglion，DRG）。DRG神經元能夠把外(wài)周刺激通過脊髓進而傳至大(dà)腦，傳遞疼痛、冷熱、癢、機械和本體(tǐ)等多種感覺。在DRG神經元中(zhōng)存在高度特化的不同類型神經元，合作實驗室張旭研究員(yuán)團隊前期的研究通過單細胞測序将DRG神經元分(fēn)爲10個大(dà)類和14個亞類，同時揭示不同類型神經元參與不同外(wài)周刺激的感覺傳遞（Li et a., Cell Research, 2016; Wang et al., Cell Research, 2021）。盡管對初級感覺神經元的分(fēn)類和功能有所了解，但神經元類型特異的分(fēn)子調控機制還遠未研究清楚。
lincRNA是一(yī)類轉錄自編碼基因間區域、缺乏蛋白(bái)翻譯能力且長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。目前多組學測序數據分(fēn)析提示，在神經系統中(zhōng)的lincRNA比mRNA具有更高的組織特異性，并可能發揮重要作用。因此，探究lincRNA在不同類型DRG神經元中(zhōng)的分(fēn)布、功能及作用機制對解析不同外(wài)周刺激引起感覺傳遞的分(fēn)子機制有重要意義。
本研究首先通過整合分(fēn)析Smart-seq2和10x Genomics的初級感覺神經元單細胞測序數據，構建了單個神經元lincRNA的表達譜。通過計算特異性指數（Specificity measure, SPM）方法篩選并發現了200個細胞類型特異且高表達的lincRNA，并進一(yī)步通過單細胞PCR、原位雜(zá)交和流式分(fēn)選等方法對不同細胞類型lincRNA進行了驗證。同時，還發現細胞類型特異的lincRNA與其基因組上臨近基因存在高度相關性，由于細胞核中(zhōng)定位的lincRNA能夠參與調控臨近基因的表達，提示細胞類型特異的lincRNA可能具有順式調控作用。
單細胞測序鑒别初級感覺神經元細胞類型特異lincRNAs
随後通過對細胞類型特異性lincRNA的進化保守性分(fēn)析，發現在生(shēng)長抑素（Sst+）表達的神經元中(zhōng)lncRNA 9130409J20Rik 特異性高表達，并且在多物(wù)種中(zhōng)保守性最高。利用基因共表達分(fēn)析，提示lncRNA 9130409J20Rik與癢覺功能高度相關，因此我(wǒ)(wǒ)們将其命名爲CLAP （Cell-type-specific LincRNA Associated with Pruritus）。進一(yī)步采用神經元鈣成像、小(xiǎo)鼠鞘内注射siRNA和AAV病毒攜帶shRNA後的癢覺行爲學檢測以及RNA-seq等實驗，發現敲低CLAP顯著抑制組胺對Sst+神經元的激活、降低小(xiǎo)鼠對組胺誘導的癢覺抓撓反應以及導緻Sst+神經元中(zhōng)與癢覺相關基因的顯著下(xià)調。最後，通過對高通量免疫共沉澱測序數據庫（CLIP-seq）分(fēn)析、RNA免疫共沉澱和小(xiǎo)鼠鞘内注射siRNA等實驗，發現RNA結合蛋白(bái)MSI2與CLAP相互結合并參與調控CLAP對癢覺相關基因的表達。
通過單細胞測序構建初級感覺神經元細胞類型特異lincRNA表達譜并發現
lincRNA CLAP調控癢覺的功能和分(fēn)子機制
綜上所述，本研究通過單細胞測序建立了初級感覺神經元類型特異分(fēn)布的lincRNA表達譜，揭示了細胞類型特異性表達的lincRNA在癢覺傳遞中(zhōng)發揮調控功能及其分(fēn)子作用機制。該研究不僅有助于深入理解神經元不同類型特異分(fēn)布的lincRNA在不同軀體(tǐ)感覺信息傳遞中(zhōng)的作用和機制，而且爲疼痛和慢(màn)性瘙癢等感覺相關疾病的發生(shēng)機制和臨床診療提供了理論基礎。
廣東省智能院王斌研究員(yuán)、中(zhōng)科院分(fēn)子細胞卓越中(zhōng)心鮑岚研究組博士研究生(shēng)姜博文和中(zhōng)科院上海營養與健康研究所楊力團隊博士研究生(shēng)李國衛爲本文共同第一(yī)作者。鮑岚研究員(yuán)、楊力研究員(yuán)和王斌研究員(yuán)爲共同通訊作者。這項工(gōng)作得到了中(zhōng)科院上海高等研究院/江門市新會區威信高技術科學研究所的張旭研究員(yuán)、江門市新會區威信高技術科學研究所的李昌林研究員(yuán)、複旦大(dà)學腦科學研究院的韓清見研究員(yuán)和浙江大(dà)學醫學院的徐貞仲研究員(yuán)的大(dà)力支持。該工(gōng)作得到了國家基金委、廣東省高水平創新研究院項目和中(zhōng)國醫學科學院項目的資(zī)助。
文章鏈接：https://www.embopress.org/doi/abs/10.15252/embr.202154313
